Чим повногеномне тестування відрізняється від ПЛР та інших методів

Здебільшого люди схильні вважати, що генетичний тест – це пошук однієї заздалегідь відомої ознаки. ПЛР-тест на ковід шукає вірусну РНК. Тест на батьківство порівнює одну й ту саму ділянку ДНК у двох людей. Тест на спадковий рак шукає одну з відомих патогенних варіацій у гені BRCA1 (breast cancer gene 1, ген 1 раку молочної залози). У кожному з цих прикладів лабораторія заздалегідь знає, що саме буде шукати, і відповідь завжди вузька: є конкретний маркер у зразку чи немає.

Повногеномне тестування працює за іншою логікою. Замість перевірки однієї обраної точки воно одночасно зчитує мільйони точок геному, без попередніх гіпотез щодо ролі кожної окремої точки. Назва «генетичний тест» залишається спільною для обох підходів. Завдання, яке вони вирішують, суттєво відрізняється.

Чим генетичний тест відрізняється від аналізу крові — ДНК-тест і аналіз крові: у чому різниця

Метод генетичного тестування визначає, наскільки повним та точним буде результат

У генетиці існує щонайменше три різні технології, які дають змогу прочитати ДНК, і кожна дає результат іншого характеру: 

1. ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) перевіряє одну заздалегідь обрану ділянку ДНК і дає точну відповідь саме про неї.

2. Генотипування одночасно зчитує сотні тисяч точок – обсяг, достатній для оцінки полігенних ризиків.

3. Повногеномне секвенування (WGS, whole genome sequencing) визначає послідовність кожного нуклеотида без жодних попередніх припущень — для задач, де потрібна максимально повна картина без обмежень на охоплення.

Це НЕ три рівні якості одного аналізу, де один метод «кращий» за інший. Це три різні інструменти, які відповідають на три різні за масштабом запитання: про одну точку, про сотні тисяч точок або про весь геном цілком.

Як працює ПЛР: одна відповідь на конкретне запитання

Метод ПЛР є дуже поширеним у лабораторній діагностиці. Лабораторія синтезує штучний праймер – короткий фрагмент ДНК, який підходить лише до однієї заздалегідь відомої генетичної мішені. Якщо ця мішень є у зразку, прилад її ампліфікує, тобто багаторазово копіює, аж доки сигнал не стане достатньо сильним для фіксації. Якщо мішені немає, ампліфікації не відбувається, а отже немає і сигналу. Результат завжди бінарний: «є» або «немає».

Під час пандемії метод дозволяв швидко й точно визначати наявність конкретних мутацій у варіантах SARS-CoV-2, відрізняючи, наприклад, Дельту від Омікрону (Esman et al., Diagnostics, 2022). У клінічній онкогенетиці той самий принцип лежить в основі цілеспрямованого тестування на вже відому в родині патогенну варіацію в BRCA1 чи BRCA2 (breast cancer gene 2, ген 2 раку молочної залози): якщо в родича вже підтверджено конкретний варіант, інших членів родини перевіряють саме на нього, а не на весь ген (Samadder et al., JAMA Oncol., 2021).

Тобто ПЛР працює винятково з тим, що заздалегідь вказали шукати. Усе, що лежить поза межами обраної мішені, для цього методу просто не існує.

Як працює генотипування: сканування геному в сотнях тисяч точок одночасно

За кожним результатом генотипування стоять два складники: платформа GSA (Global Screening Array, Illumina), яка фізично зчитує зразок, і база даних GWAS (Genome-Wide Association Study, повногеномне асоціативне дослідження), яка надає науковий контекст для інтерпретації. Разом вони дозволяють одночасно зчитати понад 600 000 точок геному за допомогою мікрочіпа, на поверхні якого закріплено стільки ж молекулярних зондів.

Кожна така точка, SNP (single-nucleotide polymorphism, однонуклеотидний поліморфізм) — це позиція в геномі, де в популяції природно зустрічаються різні варіанти однієї літери ДНК. Прилад одночасно зчитує сигнал з усіх точок і перетворює його на цифровий профіль генотипу людини (Verlouw et al., Eur. J. Hum. Genet., 2021). Масштаб такого підходу ілюструють великі біобанки: один з найвідоміших проєктів зчитував геномні масиви на чіпі майже у 500 000 учасників одночасно, отримуючи дані по сотнях тисяч точок із кожного зразка (Bycroft et al., Nature, 2018).

Чому для полігенних ризиків не підходить пошук однієї мутації

Більшість поширених станів і схильностей, які аналізує Apixmed Prism, не визначаються однією поломкою в одному гені. Вони формуються одночасною дією тисяч генетичних варіантів, кожен з яких окремо чинить мінімальний вплив. За десятиліття GWAS-досліджень, під час яких проводилися масштабні порівняння геномів сотень тисяч учасників, вдалося встановити, які саме з понад 600 000 точок на чіпі статистично пов'язані з конкретними схильностями чи станами (Uffelmann et al., Nat. Rev. Methods Primers, 2021). Сума цих зв'язків використовується для розрахунку PRS (Polygenic Risk Score, полігенний показник ризику). 

Генотипування генерує саме той масив даних, який потрібен для подібних розрахунків: сотні тисяч точок одночасно із заздалегідь відомими ваговими коефіцієнтами з GWAS-досліджень. ПЛР не здатна відтворити цей масив, адже вона перевіряє одну точку за раз, а масштабувати її на тисячі мішеней одночасно технічно недоцільно. 

Повногеномне секвенування: без заздалегідь обраних точок

WGS визначає послідовність кожного з приблизно 3 мільярдів нуклеотидів ДНК, без жодних заздалегідь обраних мішеней чи точок. Він особливо корисний тоді, коли йдеться про пошук рідкісних, ще не описаних науці варіантів: наприклад, у складних онкологічних чи орфанних клінічних випадках, де заздалегідь визначений набір точок не охоплює потрібну ділянку.

Apixmed Prism підтримує обидва підходи – і генотипування, і повне секвенування. Для більшості показників, охоплених звітом, полігенний аналіз на основі обох методів дає порівнянний клінічно значущий результат, оскільки ключові варіанти, задіяні у розрахунку, добре представлені в обох випадках. Різниця між підходами стає суттєвішою при пошуку рідкісних або нових варіантів, що виходить за межі стандартного полігенного аналізу.

Що це означає для людини, яка проходить тест

Коли ви бачите формулювання «аналізуються ~600 000 генетичних маркерів», це стосується не однієї хвороби чи однієї схильності. Це означає, що аналіз одного й того самого зразка слини дає змогу одночасно подивитися на десятки різних напрямків і оцінити як чутливість до кофеїну, так і спадкові особливості засвоєння вітамінів та сотні інших показників, без потреби здавати окремий цілеспрямований тест у пошуках відповідей на кожне окреме запитання. 

Три інструменти для трьох різних завдань

ПЛР доречна для точкової перевірки: підтвердити наявність ДНК патогену, верифікувати відому мутацію, встановити батьківство. Генотипування відкриває одночасний доступ до сотень тисяч точок геному, тобто забезпечує виконання полігенного аналізу і дає точний обсяг даних, потрібний для розрахунку ризиків, за прийнятну вартість і в розумні строки. Повногеномне секвенування використовується для завдань, де потрібна повна картина без будь-яких попередніх обмежень на охоплення. 

Дізнатися, які генетичні маркери аналізує Prism →

Відповіді на часті запитання

Чим генотипування відрізняється від ПЛР?

ПЛР перевіряє одну заздалегідь відому ділянку ДНК, генотипування одночасно зчитує сотні тисяч точок. Отже, ПЛР дає бінарну відповідь «є / немає» щодо конкретної мішені (Esman et al., Diagnostics, 2022). Генотипування натомість генерує масив сигналів з понад 600 000 точок одночасно, що дає змогу оцінювати риси, на які впливають тисячі варіантів разом (Verlouw et al., Eur. J. Hum. Genet., 2021). 

Звідки відомо, які саме SNP важливі для розрахунку PRS?

Цю інформацію дають масштабні дослідження GWAS. Вони порівнюють геноми сотень тисяч учасників, щоб встановити, які конкретні SNP статистично пов'язані з конкретними рисами чи станами (Uffelmann et al., Nat. Rev. Methods Primers, 2021). Без цих даних зчитані сигнали не мали б інтерпретації. 

Чи аналізує Apixmed Prism весь геном так само детально, як WGS?

Звіт Apixmed Prism підтримує обидва підходи — і генотипування, і повне секвенування. Генотипування зчитує заздалегідь визначені точки геному, тоді як WGS визначає послідовність кожного нуклеотида. Для оцінки спадкових особливостей і полігенних ризиків обидва методи дають клінічно значущий результат. Різниця стає суттєвою при пошуку рідкісних або ще не каталогізованих варіантів.

Чому ПЛР не може оцінити полігенний ризик? 

ПЛР перевіряє одну мішень за раз, а полігенний ризик потребує перевірки тисяч варіантів одночасно. Складні риси й поширені стани формуються сукупним впливом тисяч генетичних варіантів. Технічно масштабувати ПЛР на таку кількість мішеней одночасно недоцільно, тому для цього використовується метод генотипування.

Чи можна методом генотипуванні знайти рідкісну, ще не описану мутацію?

Генотипування обмежене заздалегідь визначеним набором точок. Чіп зчитує лише ті позиції геному, які на нього закладено під час виробництва. Пошук абсолютно нових, ще не каталогізованих варіантів є завданням повногеномного секвенування.

Результати генетичного тесту не є діагнозом і не замінюють консультацію лікаря. Звіт Apixmed Prism дає генетичний контекст, який доповнює результати обстежень і допомагає приймати рішення разом із лікарем. 

Джерела

1. Uffelmann, E., Huang, Q. Q., Munung, N. S. et al. (2021). Genome-wide association studies. Nature Reviews Methods Primers, 1, Article 59. https://doi.org/10.1038/s43586-021-00056-9

2. Verlouw, J. A. M., Clemens, E., de Vries, J. H. et al. (2021). A comparison of genotyping arrays. European Journal of Human Genetics, 29(11), 1611–1624. https://doi.org/10.1038/s41431-021-00917-7

3. Bycroft, C., Freeman, C., Petkova, D. et al. (2018). The UK Biobank resource with deep phenotyping and genomic data. Nature, 562, 203–209. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0579-z
   Esman, A., Cherkashina, A., Mironov, K. et al. (2022). SARS-CoV-2 Variants Monitoring Using Real-Time PCR. Diagnostics, 12(10), 2388. https://doi.org/10.3390/diagnostics12102388

4. Samadder, N. J., Riegert-Johnson, D., Boardman, L. et al. (2021). Comparison of Universal Genetic Testing vs Guideline-Directed Targeted Testing for Patients With Hereditary Cancer Syndrome. JAMA Oncology, 7(2), 230–237. https://doi.org/10.1001/jamaoncol.2020.6252