WGS, WES и генотипирование: как выбрать метод генетического тестирования
ДНК человека можно проанализировать несколькими технологически разными методами, и выбор метода зависит от цели анализа и типа вариантов, которые нужно выявить. Среди них — секвенирование полного генома, секвенирование экзома, генотипирование, ПЦР и другие. В генетических тестах, которые оценивают предрасположенность к наиболее распространённым состояниям, чаще всего используется именно генотипирование, поскольку оно оптимально с точки зрения информативности и стоимости. Использование ПЦР или полноэкзомного анализа здесь нецелесообразно, так как анализ одного гена не отражает полной картины предрасположенности к ряду патологий. Именно поэтому для расчёта полигенной оценки предрасположенности используют генотипирование и полногеномный анализ.
Геном, экзом и фиксированный набор вариантов: что анализирует каждый метод
Выбор метода анализа зависит от того, какую часть ДНК нужно исследовать и какие варианты в ней выявить. Одни методы определяют последовательность ДНК на всём геноме или в отдельных его участках, другие проверяют генотип в заранее заданных позициях. От этого зависит, какие варианты метод способен выявить. Это, вместе с точностью и воспроизводимостью анализа, очерчивает задачи, для которых метод может быть использован.
Полногеномное секвенирование (whole genome sequencing, WGS)
WGS позволяет исследовать последовательность практически всего генома — около 3,2 миллиарда пар оснований, то есть структурных единиц, из которых состоит ДНК. Секвенирование охватывает весь генетический материал: кодирующие участки генов, интроны (некодирующие участки внутри генов) и регуляторные последовательности, которые влияют на активность генов. Этот метод не ограничивается заранее определённым набором позиций (Kockum, Huang, & Stridh, Current Protocols, 2023).
Секвенирование экзома (whole exome sequencing, WES)
WES определяет последовательность экзома — совокупности всех экзонов, то есть белоккодирующих участков генов, которые вместе составляют примерно 1–2% генома. Фрагменты ДНК, соответствующие экзонам, избирательно захватываются перед секвенированием; остальной геном в анализ не попадает (Kockum, Huang, & Stridh, Current Protocols, 2023).
Генотипирование (SNP-массив)
Метод определяет генотип в заранее заданном наборе известных позиций с помощью гибридизационных зондов, подобранных под каждую из них. Последовательность ДНК при этом не устанавливается. Распространённая платформа Illumina Global Screening Array, например, охватывает около 700 000 маркеров (Illumina, Infinium Global Screening Array-24 v3.0 Data Sheet, 2020).
Какие классы вариантов способен выявить каждый метод
WGS: охват без заранее заданных ограничений
WGS не ограничен заранее определённым набором позиций, поэтому даёт доступ к вариантам в любой части генома: редким вариантам вне экзома, вариантам в некодирующих регуляторных участках, а также структурным вариантам. Способность выявлять структурные варианты зависит от технологии секвенирования и алгоритма анализа данных. Анализ полногеномных данных 150 119 участников UK Biobank показал, что прямое секвенирование позволяет устанавливать ассоциации для редких вариантов, точность импутации которых ограничена их низкой представленностью в референтных панелях (Halldorsson et al., Nature, 2022).
WES: глубина прочтения кодирующих участков
WES сосредотачивает секвенирование на экзоме, поэтому даёт большую глубину прочтения кодирующих участков при меньшем объёме данных, чем полногеномное секвенирование с сопоставимой глубиной (Kockum, Huang, & Stridh, Current Protocols, 2023). В диагностике наследственных состояний это отражается на соотношении результата и затрат: по данным сравнительного анализа менделевских расстройств, WGS обеспечивает более высокую частоту установления диагноза, тогда как WES с повторным анализом данных даёт более низкую стоимость исследования, и выбор между методами определяется клиническим сценарием и доступными ресурсами (Ewans et al., Eur J Hum Genet, 2022).
Генотипирование: масштабное покрытие известных позиций
PRS агрегирует вклад большого числа генетических вариантов, преимущественно распространённых в популяции, каждый из которых обычно имеет небольшой индивидуальный эффект. Для такого расчёта нужно надёжно и воспроизводимо определить генотип в большом числе уже известных позиций. Микроматрица (microarray) генотипирует фиксированный набор позиций, а генотипы в соседних, напрямую не проанализированных позициях восстанавливает импутация (статистическое дополнение данных на основе референтных панелей) (Kockum, Huang, & Stridh, Current Protocols, 2023).
Подробнее о том, как устроены генетические данные, — в статье Типы генетических данных: что стоит за SNP, гаплотипами и полигенными профилями.
Покрытие, глубина прочтения и точность генотипирования
Секвенирование и генотипирование дают данные разного типа, поэтому надёжность результата в них оценивают по разным параметрам. Для WGS и WES главными параметрами являются покрытие (какая доля целевого участка попала в анализ) и глубина прочтения (сколько раз независимо определена каждая позиция). Глубина влияет на надёжность определения варианта, особенно в гетерозиготных позициях (где унаследованные от родителей варианты различаются).
Для микроматрицы применяют другие показатели качества, в частности call rate и воспроизводимость. Call rate — доля маркеров массива, которые удалось успешно прочитать в конкретном образце. Он описывает полноту одного измерения. Воспроизводимость показывает, насколько согласуются результаты генотипирования одного и того же образца между повторными прогонами, то есть описывает стабильность платформы. По данным производителя, для Illumina Global Screening Array v3.0 средний call rate составляет 99,5% при спецификации более 99,0%, а воспроизводимость — 99,99% при спецификации более 99,90% (Illumina, Infinium Global Screening Array-24 v3.0 Data Sheet, 2020).
Качество следующего шага (импутации) оценивают отдельными метриками, в частности r², которые показывают ожидаемую надёжность импутированного генотипа. Конкретное значение зависит от алгоритма импутации, размера и состава референтной панели и способа обработки данных.
Подробнее о форматах, в которых хранятся генетические данные, — в статье Форматы генетических данных: FASTQ, PLINK, VCF и другие.
Глубина прочтения — регулируемый параметр, и от неё зависит соотношение между прямым определением генотипа и импутацией. Low-pass WGS выполняется с меньшей глубиной, чем стандартное полногеномное секвенирование, а генотипы в недостаточно покрытых позициях восстанавливаются импутацией. Для расчёта PRS такой подход может давать результаты, сопоставимые с генотипированием на микроматрице (Li, Mazur, Berisa, & Pickrell, Genome Research, 2021).
Сферы применения WGS, WES и микроматрицы
Сферу применения метода определяют и его технические возможности, и условия конкретного исследования или клинического случая:
-
WGS применяют в исследованиях генома, для поиска редких и структурных вариантов, а также в клинической диагностике наследственных состояний, когда причинный вариант может находиться вне белоккодирующих участков.
-
WES применяют в диагностике моногенных наследственных заболеваний, где поиск сосредоточен на кодирующих последовательностях.
-
Генотипирование с импутацией применяется для крупного полигенного анализа, поскольку позволяет надёжно проанализировать большое число известных маркеров и дополнять результат данными референтных панелей.
Выбор между WES и WGS в клинической практике определяется сценарием исследования и доступными ресурсами (Ewans et al., Eur J Hum Genet, 2022).
Генотипирование на микроматрице в Apixmed Prism
Генотипирование позволяет проанализировать большое число позиций по стандартизированному протоколу и с высокой воспроизводимостью результата. Оценка предрасположенности строится на совокупности множества маркеров, поэтому надёжность определения каждого из них влияет на итоговый результат.
Образец ДНК из слюны обрабатывает лаборатория на платформе, которая генотипирует около 700 000 генетических маркеров. Показатели в отчёте рассчитываются на основе проанализированных вариантов и, при необходимости, данных импутации, с использованием данных, полученных в соответствующих GWAS-исследованиях. Так формируются результаты генетических тестов и панелей Apixmed Prism.
Масштаб охвата и глубина интерпретации здесь работают вместе: чем больше маркеров входит в анализ и чем полнее доказательная база по каждому из них, тем более детальную картину генетической предрасположенности даёт отчёт.
Узнать больше о генетическом тестировании Apixmed Prism →
WGS, WES и микроматрица: ответы на частые вопросы
Можно ли позже сделать полногеномное секвенирование, если сначала сделан тест методом генотипирования?
Да. Это отдельные методы, и результаты генотипирования не ограничивают возможность позже пройти секвенирование. Для него нужен новый образец, поскольку методы используют разные протоколы подготовки ДНК.
Означает ли выбор чипа для генотипирования, что часть генетической информации остаётся недоступной?
Чип генотипирования анализирует заранее определённый набор позиций. Вопросы, которые выходят за пределы этого набора — например, поиск редких вариантов, не охваченных конструкцией чипа, — решают с помощью WES или WGS.
Означает ли WGS автоматически более точный генетический тест?
Нет. WGS даёт более широкий охват последовательности ДНК, но точность и полезность результата зависят от конкретного класса вариантов, глубины секвенирования, алгоритмов анализа и поставленной задачи.
Можно ли напрямую сравнивать результаты полногеномного секвенирования и теста на основе генотипирования?
Напрямую — нет, поскольку методы по-разному определяют генотип и охватывают разные участки генома. Сравнивать можно конкретные показатели, если они рассчитаны по одинаковым моделям PRS и с использованием сопоставимых референтных панелей.
Результаты генетического теста — это не диагноз и не замена консультации врача. Отчёт Apixmed Prism даёт генетический контекст, который дополняет результаты обследований и помогает принимать решения вместе с врачом.
Источники
1. Kockum, I., Huang, J., & Stridh, P. (2023). Overview of genotyping technologies and methods. Current
Protocols, 3(4), e727. https://doi.org/10.1002/cpz1.727
2. Halldorsson, B. V., и др. (2022). The sequences of 150,119 genomes in the UK Biobank. Nature, 607(7920), 732–740. https://doi.org/10.1038/s41586-022-04965-x
3. Li, J. H., Mazur, C. A., Berisa, T., & Pickrell, J. K. (2021). Low-pass sequencing increases the power of GWAS and decreases measurement error of polygenic risk scores compared to genotyping arrays. Genome Research, 31(4), 529–537. https://doi.org/10.1101/gr.267229.120
4. Illumina, Inc. (2020). Infinium Global Screening Array-24 v3.0 BeadChip: Data Sheet (документ 370-2016-016-G).
5. Ewans, L. J., Minoche, A. E., Schofield, D., et al. (2022). Whole exome and genome sequencing in mendelian disorders: a diagnostic and health economic analysis. European Journal of Human Genetics, 30(10), 1121–1131. https://doi.org/10.1038/s41431-022-01162-2м
