WGS, WES і генотипування: як обрати метод генетичного тестування
ДНК людини можна проаналізувати кількома технологічно різними методами, і вибір методу залежить від мети аналізу та типу варіантів, які потрібно виявити. Серед них — секвенування повного геному, секвенування екзома, генотипування, ПЛР та інші. У генетичних тестах, які оцінюють схильності до найбільш поширених станів, найчастіше використовується саме метод генотипування, з огляду на те, що це найбільш оптимальний в контексті інформативності та вартості. Так, використання ПЛР або повноекзомного аналізу не є доцільним, адже аналіз одного гена не відображає повної картини схильності до ряду патологій. . Саме тому, для її розрахунку полігенної оцінки схильності і використовують генотипування та повногеномний аналіз.
Геном, екзом і фіксований набір варіантів: що аналізує кожен метод
Вибір методу аналізу залежить від того, яку частину ДНК потрібно дослідити і які варіанти в ній виявити. Одні методи визначають послідовність ДНК на всьому геномі або в окремих його ділянках, інші перевіряють генотип у заздалегідь заданих позиціях. Від цього залежить, які варіанти метод здатен виявити. Це, разом із точністю та відтворюваністю аналізу, окреслює задачі, для яких метод може бути використаний.
Повногеномне секвенування (whole genome sequencing, WGS)
WGS дає змогу досліджувати послідовність практично всього геному — близько 3,2 мільярда пар основ, тобто структурних одиниць, з яких складається ДНК. Секвенування охоплює увесь генетичний матеріал - кодуючі ділянки генів, інтрони (некодуючі ділянки всередині генів) та регуляторні послідовності, які впливають на активність генів. Цей метод не обмежується заздалегідь визначеним набором позицій (Kockum, Huang, & Stridh, Current Protocols, 2023).
Секвенування екзома (whole exome sequencing, WES)
WES визначає послідовність екзома — сукупності всіх екзонів, тобто білоккодуючих ділянок генів, які разом становлять приблизно 1–2% геному. Фрагменти ДНК, що відповідають екзонам, вибірково захоплюються перед секвенуванням; решта геному в аналіз не потрапляє (Kockum, Huang, & Stridh, Current Protocols, 2023).
Геномипування (SNP-масив)
Метод визначає генотип у заздалегідь заданому наборі відомих позицій за допомогою гібридизаційних зондів, підібраних під кожну з них. Послідовність ДНК при цьому не встановлюється. Поширена платформа Illumina Global Screening Array, наприклад, охоплює близько 700 000 маркерів (Illumina, Infinium Global Screening Array-24 v3.0 Data Sheet, 2020).
Які класи варіантів здатен виявити кожен метод
WGS: охоплення без наперед заданих обмежень
WGS не обмежений заздалегідь визначеним набором позицій, тому дає доступ до варіантів у будь-якій частині геному: рідкісних варіантів поза екзомом, варіантів у некодуючих регуляторних ділянках, а також структурних варіантів. Здатність виявляти структурні варіанти залежить від технології секвенування та алгоритму аналізу даних. Аналіз повногеномних даних 150 119 учасників UK Biobank показав, що пряме секвенування дає змогу встановлювати асоціації для рідкісних варіантів, точність імпутації яких обмежена їхньою низькою представленістю в референтних панелях (Halldorsson et al., Nature, 2022).
WES: глибина прочитання кодуючих ділянок
WES зосереджує секвенування на екзомі, тому дає вищу глибину прочитання кодуючих ділянок за меншого обсягу даних, ніж повногеномне секвенування з порівнянною глибиною (Kockum, Huang, & Stridh, Current Protocols, 2023). У діагностиці спадкових станів це відображається на співвідношенні результату й витрат: за даними порівняльного аналізу мендельних розладів, WGS забезпечує вищу частоту встановлення діагнозу, тоді як WES із повторним аналізом даних дає нижчу вартість дослідження, і вибір між методами визначається клінічним сценарієм та доступними ресурсами (Ewans et al., Eur J Hum Genet, 2022).
Генотипування: масштабне покриття відомих позицій
PRS агрегує внесок великої кількості генетичних варіантів, переважно поширених у популяції, кожен із яких зазвичай має невеликий індивідуальний ефект. Для такого розрахунку потрібно надійно й відтворювано визначити генотип у великій кількості вже відомих позицій. Мікроматриця (microarray) генотипує фіксований набір позицій, а генотипи в сусідніх, безпосередньо не проаналізованих позиціях відновлює імпутація (статистичне доповнення даних на основі референтних панелей) (Kockum, Huang, & Stridh, Current Protocols, 2023).
Детальніше про те, як влаштовані генетичні дані, — у статті Типи генетичних даних: що стоїть за SNP, гаплотипами і полігенними профілями.
Покриття, глибина прочитання і точність генотипування
Секвенування і генотипування дають дані різного типу, тому надійність результату в них оцінюють за різними параметрами. Для WGS і WES головними параметрами є покриття (яка частка цільової ділянки потрапила в аналіз) і глибина прочитання (скільки разів незалежно визначена кожна позиція). Глибина впливає на надійність визначення варіанта, особливо в гетерозиготних позиціях (де успадковані від батьків варіанти різні).
Для мікроматриці застосовують інші показники якості, зокрема call rate і відтворюваність. Call rate — частка маркерів масиву, які вдалося успішно прочитати в конкретному зразку. Він описує повноту одного вимірювання. Відтворюваність показує, наскільки узгоджуються результати генотипування того самого зразка між повторними прогонами, тобто описує стабільність платформи. За даними виробника, для Illumina Global Screening Array v3.0 середній call rate становить 99,5% за специфікації понад 99,0%, а відтворюваність — 99,99% за специфікації понад 99,90% (Illumina, Infinium Global Screening Array-24 v3.0 Data Sheet, 2020).
Якість наступного кроку (імпутації) оцінюють окремими метриками, зокрема r², які показують очікувану надійність імпутованого генотипу. Конкретне значення залежить від алгоритму імпутації, розміру та складу референтної панелі й способу обробки даних.
Детальніше про формати, у яких зберігаються генетичні дані, — у статті Формати генетичних даних: FASTQ, PLINK, VCF та інші.
Глибина прочитання є регульованим параметром, і від неї залежить співвідношення між прямим визначенням генотипу та імпутацією. Low-pass WGS виконується з меншою глибиною, ніж стандартне повногеномне секвенування, а генотипи в недостатньо покритих позиціях відновлюються імпутацією. Для розрахунку PRS такий підхід може давати результати, порівнянні з генотипуванням на мікроматриці (Li, Mazur, Berisa, & Pickrell, Genome Research, 2021).
Сфери застосування WGS, WES і мікроматриці
Сферу застосування методу визначають і його технічні можливості, і умови конкретного дослідження чи клінічного випадку:
-
WGS застосовують у дослідженнях геному, для пошуку рідкісних і структурних варіантів, а також у клінічній діагностиці спадкових станів, коли причинний варіант може лежати поза білок кодуючими ділянками.
-
WES застосовують у діагностиці моногенних спадкових захворювань, де пошук зосереджений на кодуючих послідовностях.
-
Генотипування з імпутацією застосовується для великого полігенного аналізу, оскільки дає змогу надійно проаналізувати велику кількість відомих маркерів і доповнювати результат даними референтних панелей.
Вибір між WES і WGS у клінічній практиці визначається сценарієм дослідження та доступними ресурсами (Ewans et al., Eur J Hum Genet, 2022).
Генотипування на мікроматриці в Apixmed Prism
Генотипування дає змогу проаналізувати велику кількість позицій за стандартизованим протоколом і з високою відтворюваністю результату. Оцінка схильності будується на сукупності багатьох маркерів, тому надійність визначення кожного з них впливає на підсумковий результат.
Так, зразок ДНК зі слини обробляє лабораторія на платформі, що генотипує близько 700 000 генетичних маркерів. Показники у звіті розраховуються на основі проаналізованих варіантів і, за потреби, даних імпутації, отриманий для відповідних GWAS-досліджень. Так формуються результати генетичних тестів і панелей Apixmed Prism.
Масштаб охоплення й глибина інтерпретації тут працюють разом: чим більше маркерів входить в аналіз і чим повніша доказова база за кожним із них, тим детальнішу картину генетичної схильності дає звіт.
Дізнатися більше про генетичне тестування Apixmed Prism →
WGS, WES і мікроматриця: відповіді на поширені запитання
Чи можна пізніше зробити повногеномне секвенування, якщо спершу зроблено тест методом генотипування?
Так. Це окремі методи, і результати генотипування не обмежують можливість пізніше пройти секвенування. Для нього потрібен новий зразок, оскільки методи використовують різні протоколи підготовки ДНК.
Чи означає вибір чипу для генотипування, що частина генетичної інформації лишається недоступною?
Чип генотипування аналізує заздалегідь визначений набір позицій. Питання, які виходять за межі цього набору — наприклад, пошук рідкісних варіантів, не охоплених конструкцією чипа, — вирішують за допомогою WES або WGS.
Чи означає WGS автоматично точніший генетичний тест?
Ні. WGS дає ширше охоплення послідовності ДНК, але точність і корисність результату залежать від конкретного класу варіантів, глибини секвенування, алгоритмів аналізу та поставленої задачі.
Чи можна напряму порівнювати результати повногеномного секвенування і тесту на основі генотипування?
Напряму — ні, оскільки методи по-різному визначають генотип і охоплюють різні ділянки геному. Порівнювати можна конкретні показники, якщо вони розраховані за однаковими моделями PRS і з використанням зіставних референтних панелей.
Результати генетичного тесту — це не діагноз і не заміна консультації лікаря. Звіт Apixmed Prism дає генетичний контекст, який доповнює результати обстежень і допомагає приймати рішення разом із лікарем.
Джерела
1. Kockum, I., Huang, J., & Stridh, P. (2023). Overview of genotyping technologies and methods. Current
Protocols, 3(4), e727. https://doi.org/10.1002/cpz1.727
2. Halldorsson, B. V., та ін. (2022). The sequences of 150,119 genomes in the UK Biobank. Nature, 607(7920), 732–740. https://doi.org/10.1038/s41586-022-04965-x
3. Li, J. H., Mazur, C. A., Berisa, T., & Pickrell, J. K. (2021). Low-pass sequencing increases the power of GWAS and decreases measurement error of polygenic risk scores compared to genotyping arrays. Genome Research, 31(4), 529–537. https://doi.org/10.1101/gr.267229.120
4. Illumina, Inc. (2020). Infinium Global Screening Array-24 v3.0 BeadChip: Data Sheet (документ 370-2016-016-G).
5. Ewans, L. J., Minoche, A. E., Schofield, D., et al. (2022). Whole exome and genome sequencing in mendelian disorders: a diagnostic and health economic analysis. European Journal of Human Genetics, 30(10), 1121–1131. https://doi.org/10.1038/s41431-022-01162-2
